D. Yu, Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fungus phytopathogenicus Colletotrichum coccodes periculosos morbos causat in potatoes et tomatoes quae notae sunt anthracnosa et tuber macula nigra. In notis morphologicis saepe difficile est discernere a morbis ab aliis microorganismis causatis; in viridi lycopersiciSusceptibility fructibus, morbus asymptomaticus esse potest, se solum in fructibus maturis rubris manifestans. Ad vivam et accuratam diagnosis pathogeni, systema reali-pcr experimenti temporis oblatum est. Ad experimentum explicandum, sequentia nucleotide glyceroli triphosphatis gene dehydrogenas 45 C. coccodes modos a tuberibus annuorum separatim in diversis Russiae regionibus determinavit.
Fundatur in eventibus consecutis et analysi similium sequentiarum aliarum specierum quae in GenBank database, primariis speciebus specialibus et probe pro C. coccode designatae sunt. Ad reprimendam specificitatem systematis testium creati, PCR cum DNA separatim a puris culturarum 15 generibus fiebat, fungi parasitici et saprotrophici cum lycopersicis et annuis plantis associati (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani. , Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Praesentia Colletotrichum coccodes DNA in cyclo limen 20-27 statutum est, dum aliae species post 40 cyclos detectae vel non detectae sunt. Systema explorationis efficit ut certo deprehendas C. coccodes DNA concentrationes nimio 0.01 ng/mm3 in PCR mixtione enucleata. Systema probatum enucleatum adhibitum est ad investigandum praesentiam C. coccodes in foliis lycopersicis cum symptomata morborum fungalorum et in tubers tuberosos sine externa indicia morbi. Folia cum symptomata infectionis fungalis collecta sunt ex duobus diversis agris in regione Krasnodar, tubera - ex agris in Kostroma, Moscuae, Kaluga, Nizhny Novgorodorum regionum. Unum folium lycopersicum continens C. coccodes DNA in Territorio Krasnodar repertus est; insignis DNA huius pathogeni praesentia deprehensa est in 5 speciebus tuberum in regionibus Kostroma, Moscuae, Kaluga crevit.
introduction
Fungos generis Colletotrichum periculosum phytopathogenorum frugum, leguminum, herbarum, fructus perennis et baccae plantarum. Una e speciebus ubiquitous huius generis, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, agens anthracnose et macula nigra potatoes et tomatoes causat, et morbos aliquot aliarum plantarum familiae Solanaceae causat, incl. herbae (Dillard, 1992). C. coccodes omnes subterraneas partes plantae, caulis basium, folia et fructus afficit (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). In cortices tuberum tuberculorum infectis, progressus maculis grisiis distincte acutis observatur, in quibus punctis nigricantibus sporulationis et microsclerotia conspicua sunt. In repositione ulcera cum contentis emollitis in pulpa tuberum formare possunt, i.e. anthracnosum tempus morbus intrat, quod tamen rarissimum est.
Eodem tempore salubria anthracnosa (ulcera cutis cum punctis parvis nigris) sunt typi lycopersici fructuum. In foliis, indicia C. coccodes apparent sicut maculis fuscis fuscis, texturae flavis saepinae (Johnson, 1994).
Evolutio maculae nigrae in tubers speciem suam corrumpit, quae praecipue pronuntiatur cum potatoes rubrum cortices rubentes vendentes lavant. Peel delaminatio ad evaporationem excessum ducit et damna repono aucta (Hunger et McIntyre, 1979). Damnum ad alia organa plantae detrimentum cedit, quod in terra aperta et clausa notabatur (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Morbi a C. coccodes communes sunt in omnibus fere mundi regionibus annuis producendis, etiam Russia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Moderatio horum morborum difficilis est ob sufficientem efficaciam fungiciderum existendi contra C. coccodes et defectum varietatum repugnantium (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inoculum in tubers seminis perseverare potest (Read, celare, 1988; Johnson et al., 1997), semina lycopersica (Ben-Daniel et al., 2010), diu in solo superstites, in obstantia plantarum Dillard, 1990 : Dillard et Cobb, 1993 et in zizania (Raid, Pennypacker, 1987). Complurium auctorum opera (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) docuimus progressionem morbi in potatoes et lycopersicis late ex praesentia pendere. de inoculo in semine ac solo. Ergo ut detrimenta morbi minimizent, necesse est egritudo (inclusa quantitativa) propagulas fungus in materia seminis, in solo, in semine tuberosorum et semina lycopersica pro repositione posita. Diagnostica morphologica in terra et materia plantarum solum praesentia microsclerotia perfici possunt, quae tamen etiam in aliis fungis generibus inveniuntur.
Signa in tubers simillima sunt scabie argenteo fungus Helminthosporii solani causata. Solatio Colletotrichum coccodes et Helminthosporium solani in puram culturam magis difficilis est et diu ob lenti incrementi in nutrienti medio sumit. Ut cito Colletotrichum coccodes cognoscas, necesse est methodis diagnosticis instrumentalibus uti. Methodus commodissima est catenae reactionis polymerase (PCR) eiusque modificationis - real-time PCR. Nunc, experimentum systematis ab inquisitoribus Britannicis (Cullen et al., 2002) explicatum pro regione rDNA ITS1 in Europa et Civitatibus Foederatis Americae adhibetur. Eius usus bonos eventus ostendit in analysi isolate Russiae (Belov et al, 2018). Sed C. coccodes valde varius est et eius detectio ex unico DNA serie ad falsos eventus negativos ducere potest. Pro diagnosi certius, necesse est plures series specierum DNA specierum resolvere, in quibus nexum systematis testium originalium enucleavimus, quae C. coccodes distinguit per seriem gene dehydrogenae 3-phosphatae glyceraldehydae.
materiae et methoda
Ad efficaciam et proprietatem rationum testium creatarum perpendere, puros culturas 15 specierum fungi ab auctoribus segregatas usi sumus ab affectis exemplis lycopersicorum et fructuum, tuberum tuberosum (Tabula 1). Nam solitudo organa plantarum cum symptomata contagionis fungal cepimus, non plus quam unum organum per rubum.
Frustum tuber cum cortices, segmentum fructus lycopersiciSusceptibility, et folium affectatum sub microscopio binoculari positi sunt, post quod mycelium, sporis, vel particula texti in medium agar (wort agar) in medium translata sunt. Acetabulum Petri cum acuto dissecandi acus. Repositae sunt solitariae super agar obliquis in tubulis testium in 4° C.
Exemplaria foliorum lycopersicorum cum indiciis morborum fungalorum, analysi destinatorum, statim post collectionem (in agro) in 70% alcohole positae sunt, in quo usque DNA solitudo repositae sunt. Tubos annuos officinarum traditi sunt, depilatus (2 1 cm fragmentum) ab eis, et concretum ad -20° С. Condita est donec DNA solitudo constringitur.
Purae fungi culturae segregationis pro DNA in medio liquore pisi creverunt. Mycelium fungus remotum est a medio liquido, in charta filter siccatum, in nitrogenium liquidum, homogenized, incubatum in quiddam CTAB, purgatum cum chloroformi, praecipitatum mixtura isopropanol et 0.5 M potassae acetatis, bis cum 2% ablutum. arcu. Inde DNA in aqua deionizata dissoluta et in -70° condita (Kutuzova et al., 20). DNA intentio mensurata est utens quantitatis HS DNA ornamentum pro duplici subductis DNA in Qubit 2017 (Qiagen, Germania). Exemplaria alcoholisa et congelata in nitrogen liquida triturabantur, tunc DNA extractio sicut supra (pro mycelio puro culturarum fungalorum).
Mensa 1. Origo cantilenarum fungi in opere
Fungus nomen | Plant, organ | Locus electionis |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani. | annuum tuber | Regio Kostroma, tuberosos annuos generationis 1 campi, cultivar Rubri Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | annuum folium | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | annuum tuber | Magadan tellus, pos. Tabernaculum, tuberculum annuum |
Cladosporium fulvum | lycopersiciSusceptibility folium | Moscoviae tellus, magna-fruited consectetur |
Alternaria tomatophila | lycopersiciSusceptibility fructus | per virgam laboratorium mycologiae et phytopathologiae traditae ab Instituti Praesidii Plantae Investigationis All-Russian |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | lycopersiciSusceptibility fructus | Territorium Krasnodar, districtus Crimeanus, gradus Cream |
Fusarium oxysporum | triticum radix | Regionis Moscow. |
PCR facta est in amplificatore DTprime (DNA-Technologia). Pro PCR, primigenii primigenii et speciminis regionis glyceroli dehydrogenas generum specierum specialium adhibiti sunt: deinceps primarius Coc70gdf -TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, e contrario primarius Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1, specillum. Primarii ampliant regionem 213 bp.
Reactio 50 ng sumpsit totalis DNA (cum folia et tubera dividens) et 10 ng (cum DNA culturas puras fungalis dividendo). Reactio mixtionis (35 μl) separata est a paraffin strato in duas partes: inferior (20 μl) continebat 2 μl of 10 quiddam reactionis (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4, 25 mM MgCl2, 0.1% Tween- 20), 0.5 mM cujusvis deoxynucleotide triphosphate, cujusvis primarii 7 pmol, et 4 pmol de specillo hydrolyzabili fluorescentis; superior contenta 1 µl ex 10 PCR quiddam et 1 U Taq polymerasi.
Separatio mixtionis cum paraffino permittit fistulas diu temperaturas 5°C condi et providere in initio calidi PCR calefactionis eas per 10 min ad temperiem supra 80°C. PCR fiebat secundum sequentem rationem: 94.0 ° C - 90 s (1 cyclus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 circuitus); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 circuitus); 10.0 ° C - repono.
Results ac disputationem
Sequentias generum glycerolorum triphosphatis dehydrogenas in 45 modos solitas a foliis, caulibus, tuberibus annuis, et fructibus lycopersicis (Kutuzova, 2018) determinatae sunt. Sequentiarum investigatarum omnium modorum divisae sunt in 2 circulos in duobus nucleotidis differentes. Sequentiae nucleotide repraesentativorum utriusque coetus sub numeris KY496634 et KY496635 in GenBank repositae sunt.
Primariorum coc70gdf, coc280gdr et cocgdz specillum in eorum fundamento designati sunt, programmate inspirationis utentes (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) in omnibus seriebus glyceroli triphosphatis dehydrogenas gene speciei generis Colletotrichum et aliis organismis in promptu datorum GenBank.
Nullae DNA regiones aliorum organismi primis primis homologis valde et probe inventi sunt.
Sensus systematis experimenti repressus est utens exemplaria cum diversis concentratione C. coccodes DNA, DNA e folium annuum anthracnoso infectis (collectis 2017 in Mari El, varietatis rubri Scarlett), et cortices tuberum macula nigra (collecta. in regione Kostroma, varietas rubra Scarlett, Tabula 2). Ad confirmandam praesentiam DNA in tubers et folia tuberosa, C. coccodes modos ab illis in culturas puras separatae sunt.
Eventus analyseos sensibilitatis systematis probandi ostendunt posse adhiberi ut feliciter egritudo praesentia C. coccodes DNA in exemplo sit, cum tota eius contenta in PCR mixtura plus quam 0.05 ng sit. Hoc satis ad detectionem satis est, quoniam sclerotia una continet in mediocris, 0.131 ng, et una sporarum continet circiter 0.04 ng of DNA (Cullen et al., 2002). Systema probatum, quod ab Anglico circulo (Cullen et al., 2002) explicatum est, ostendit simile sensitivum (liminis cycli 34 ad 0.05 ng DNA et 37 ad 0.005 ng).
Analysis exemplorum naturalium continens C. coccodes in omnibus casibus effecit ut suam praesentiam in sample (Tabula II) fideliter revelaret. Proposita methodus solitudo DNA applicata etiam ad exemplaria plantarum naturalium analysi.
Mensa 2. Determinatio sensibilitatis systematis testium propositarum ad identificatio Colletotrichum coccodes ad tempus reale PCR.
sample | Moles DNA in sample *, ng | Limen exolvuntur | Deprehensio C. coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Tuberculum cortices 1 | 50 | 32 | + |
Tuberculum cortices 2 | 50 | 30 | + |
Tuberculum cortices 3 | 50 | 31.5 | + |
Capsicum annuum folium | 50 | 29.5 | + |
Nota. * in mixtura pcr producta.
Probatio speciei systematis testi in DNA speciminibus extractis e 15 speciebus fungi peractum est. Omnes fungi modos ab auctoribus segregati sunt a fructibus affectis et salubribus ac foliis tuberculorum lycopersicorum; unus cola a radice triticeo remotus (Tabula 1). Inter species solitariae a superficie fructus, etiam species quae non sunt pathogeniae pro tomato (exem. Phellinus ferrugineovelutinus).
Studiorum ostendimus C. coccodes DNA in cyclo limen 20-27 deprehensos esse, cum aliae species fungales non detectae sint vel signum post cyclum 40 dederint, quod effectui soni non specificati tribui potest (Tabula 3).
Mensa 3. Reprehendo ratio test pro variis fungorum generibus
Fungus nomen | Limen exolvuntur |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. coccodes 2 | 22.6 |
C. coccodes 3 | 23 |
C. coccodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticillae | > 40 |
Verticillium albo Rhizoctonia | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alterna | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Nota. * Moles DNA in omnibus exemplaribus erat 10 ng.
Systema experimenti elaboratum adhibitum ad C. coccodes in lycopersicis exemplaribus foliorum lycopersicorum adhibitis cum symptomata necrotrophica pathogens et tuberum tuberosum semen sine visibilibus symptomatibus. Pro studio cepimus semen ficos variarum varietatum in Kostroma, Moscovia, Kaluga, Nizhny Novgorod regionibus crevisse. Praesentia C. coccodes DNA significans in speciminibus habebatur, in analysi quarum cycli limen non excedunt 35. Valor liminis electus est in certa determinatione 0.05 ng C. coccodes DNA (limen cycli 33.5; Tabula 2) et quod cyclos limen supra 40, non specificae DNA alterius fungi speciei diagnoscatur. Hoc accessu, significantes praesentia C. coccodes DNA detecta sunt 5 exemplaria tuberum in Kostroma, Moscuae, Kaluga regiones et in uno folium lycopersicum e regione Yeisk regionis Krasnodar (Tabulae 4, 5).
Tabula 4. Deprehensio Colletotrichum coccodes in tubers annuos *
Sample numerus | Capsicum annuum | Locum incrementum | Deprehensio C. coccodes | Limen exolvuntur |
---|---|---|---|---|
1 | Red coccineum | Kostroma region | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Regionis Moscow. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky diluculo | Regionis Moscow. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga region | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasy | Kaluga region | - | |
15 | Song 'Ð ° »° | Nizhny Novgorod regionem. | - | |
16 | - |
Nota. * Moles DNA in omnibus exemplaribus erat 50 ng.
Tabula 5. Deprehensio Colletotrichum coccodes in foliis lycopersicis *
Sample numerus | Locum incrementum | Deprehensio C. coccodes | Limen exolvuntur |
---|---|---|---|
1 | Territorium Krasnodar, Districtus Crimean | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar Territorium, Yeisk District | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Moles DNA in omnibus exemplaribus erat 50 ng.
Systema probatum a nobis creatum non minor est quam ab investigatoribus Britannicis (Cullen et al., 2002) in sensu et in specie evoluta est et ad exemplaria analysin apta est. Eius applicatio ad analysin tuberum seminis perduxit, ut cognosceret C. coccodes DNA in tuberibus sine notis externis damni et infectio foliorum feliciter resolvere.
Ad diem, nulla analysis tuberum tuberorum ad infestationem C. coccodes in Russia peracta est. Primum studium nostrum demonstravit ex 16 experimentis tuberum semen in diversis regionibus Foederationis Russiae crevisse, 5 continent C. coccodes. Hoc ostendit maculam tuberculorum tuberosum nigrum in Russia annuum commune esse, eiusque munus in reducendo volumen et qualitatem segetis annui minoris aestimatur.
Analysis foliorum lycopersicorum significantem praesentiam C. coccodes DNA manifestavit in uno folio e Territorii Yeisk Districtus Krasnodar. Antea, cum in Russia meridionali in Russia meridionali explorando agros televisificas utentem systematis Britannici (Cullen et al., 2002), folia continens C. coccodes innotuerunt, et in quibusdam campis magna proportio foliorum cum C. coccode infectis inventa est (Belov et al., 2018). In Territoriis Krasnodar et Primorsky, Regio Moscoviae, fructus lycopersiciosos invenimus, ex quibus puros culturas C. coccodes separare potuimus. Fieri potest ut C. coccodes multo latius in lycopersica in Russia quam nunc creditur, eiusque noxa etiam minoris aestimatur.
Ita, ut moderno tempore, satis notitiae in divulgata distributione C. coccodes in potatoes et lycopersicis congesta sunt.
Ut melius munus huius fungus in evolutione annui et morbi lycopersicii intelligatur, necesse est eius praevalentiam in Russia monitori, partes terrae et seminis contagiones studere, et munus maculae nigrae in damnis in repositione. Usus PCR diagnosticorum insigniter hoc opus faciliorem reddere potest, et usus simultaneus utriusque systematis testium accurate analysin augebit.
Hoc opus concessione e Scientiae Russicae Foundation N. 18-76-00009 sustentata est.
Articulus publici iuris factus est in ephemeride "Mycologia et Phytopathologia" (tomi 54, No. 1, 2020).